间充质干细胞成骨及成脂诱导培养基标准制作方法

间充质干细胞成骨及成脂诱导培养基标准制作方法

间充质干细胞培养细胞诱导分化时必然用到的就是培养液，配置出合适的培养液能够促进细胞的分化，因此这一步操作时相当的关键。如何才能配置适合的诱导培养液呢？济南中赛生物来介绍成骨与成脂诱导培养液的配备方法。

1.准备含10%FBS的α-MEM培养液；

2.在备好的α-MEM培养液中添加50μM 抗坏血酸, 10mmβ-磷酸甘油和100nm地塞米松；

3.准备6孔培养板，将P4细胞按照5×103个/平方厘米的规格接种于原始α-MEM培养液中；

4.待细胞长至基本融合后，更换上述制备完成的成骨诱导培养液；

5.每三天换液一次，细胞长至7天时进行碱性磷酸酶染色；

6.二十八天后再进行矿化结节的茜素红染色。

茜素红染色方法介绍：

1.去除细胞当前使用培养液，使用PBS清洗两次；

2.使用10%甲醛室温固定15分钟，完成后使用重蒸馏水冲洗两次；

3.按照1ml/孔加入40mM的茜素红染色液，室温孵育20min并轻微振荡；

4.清除掉没有完全结合的染料，用重蒸馏水漂洗并振荡5min重复4次；

5.倾斜放置2min,吸取多余的重蒸馏水；倒置显微镜观察拍照记录。

成脂诱导培养液配备与诱导操作：

1.配置FBS10%含量的HG-DMEM培养液；

2.在配制完成的HG-DMEM培养液中加入1μM地塞米松,10μg/ml胰岛素，200μM吲哚美辛和0.5mM IBMX；

3.准备6孔培养板，将P4细胞按照2×104个/平方厘米的规格接种于原始HG-DMEM培养液中

4.待细胞长至基本融合后，更换上述制备完成的成脂诱导培养液培养2天，在用只含有10μg/ml胰岛素的成脂维持培养液培养1天，如此交替循环培养至14天，使用红油O染色。

红油O染色方法介绍：

1.去除细胞使用的当前培养液，使用PBS清洗两次；

2.27.5%甲醛室温固定20分钟；

3.重蒸馏水清洗3此，空气中干燥；

4.加入0.5%的红油室温孵育一小时；

5.配制70%乙醇溶液清洗3次；

6.倒置显微镜观察拍照记录。