CRISPR-Case9载体构建步骤

CRISPR-Case9载体构建步骤

成熟的CRISPR-Case9载体构建步骤

1. Adapter 制备

按下述10 μl体系制备adapter：

引物F（终浓度1.0 μM） 10 μM的引物1 μl

引物R（终浓度1.0 μM） 10 μM的引物1 μl

0.5×TE或ddH2O 8 μl

90℃孵育10 s，然后置于室温。

2. sgRNA表达盒制备

每个sgRNA表达盒按以下体系进行反应：

1 μl 10×Cutsmart Buffer

10-20 ng pYLsgRNA （取20ng）

ATP（终浓度0.5-1.0 mM）（取1.0 mM）

0.3-0.5 μl adapter（终浓度0.03-0.05 μM）

3 U BsaI-HF

20 U T4 DNA 连接酶（用1×T4 DNA ligase buffer稀释）

ddH2O加至终体积10 μl

PCR反应，37℃ 5 min ，20℃ 5min，5个循环。注意：不要用热盖，同时避免酶过量、反应时间过长。

3. PCR

第一轮PCR：

将上一步得到的sgRNA表达盒稀释10倍，按Phanta 25 μl体蚊争系进行反应（此轮反应中，每个目的编辑基因包含两个独立反应）：

2×Phanta Buffer 12.5 μl

10×dNTP 0.5 μl

引物 1 μl +1 μl（UF/RP，FP/gR-R，FP和RP分别为adapter正反向引物）

sgRNA-adapter 1.5 μl

Phanta 0.5 μl

ddH2O 7.5 μl

反应程序：

预热 95℃ 5 min

变性 95℃ 15 s

退火 60℃ 15 s

延伸 72℃ 20 s

最终延伸 72℃ 10 min

28个循环

第二轮PCR（将第追爱一轮PCR产物稀释10倍，将目的编辑基因对应产物等量混合）：

预热 95℃ 5 min

变性 95℃ 15 s

退火 胳泪返58℃ 15 s

延伸 72℃ 40 s

最终延伸 72℃ 10 min

30个循环

切胶回收

扩增sgRNA盒对应长度：LacZ-OsU6a-sgRNA=832 bp; OsU6a-sgRNA=629 bp; OsU6b-sgRNA=515 bp; LacZ-OsU3m-sgRNA=767 bp; OsU3msgRNA=564 bp

4. Cas9载体构建

设置如下反应：

1.5 µl 10×CutSmart buffer

ATP （终浓度1.0 mM, 或加1µl 10 x NEB T4 DNA ligase buffer）

60-100 ng pYLCRISPR/Cas9

10-100 ng sgRNA cassettes

10 U BsaI-HF

40 U T4 DNA ligase

ddH2O至15 µ

sgRNA盒对应量：

1 10 ng

2 20-30 ng

3 40-50 ng

4 60-70 ng

载体和插入片段摩尔比：1:4-6。

PCR反应：

37℃ 10 min

10℃ 5 min

20℃ 5 min

以上3个循环

37℃ 3 min

10℃ 5 min

20℃ 5 min

以上10个循环。